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NGL-Impact A ELISA试剂盒性能总结

技术笔记

NGL-Impact® A ELISA 试剂盒性能总结

简介

Repligen NGL-Impact® A ELISA 试剂盒 (目录号 9222-1) 适用于对残留的NGL-Impact® Protein A进行检测和定量。 该试剂盒专为需要对抗体产品中的小量污染性NGL-Impact® A 进行高灵敏度分析的用户而开发。NGL-Impact® A 污染物的检测会在产品开发和商业化生产的多个不同阶段进行,其中包括:

  • 在特定条件下,针对填料配基脱落特性的工艺开发 
  • 生产,通常需对纯化工艺中多个不同点采集的洗脱样品进行分析
  • 终产品放行时文件记录工艺污染物水平和批次间的一致性

以下总结报告包括了在存在人免疫球蛋白G(hIgG)的情况下,从NGL-Impact® A ELISA试剂盒的评估实验中收集的性能数据。此处数据证实:

  • 使用Dilute & Go 方法,可在PBS-T缓冲液中存在高达0.5 mg/ml hIgG时,检测NGL-Impact® A,使用Boil & Boost 方法,样品可达 10 mg/ml hIgG。
  • 回收率(准确性)、分析间和分析内精确性、定量限和检测限 
     
结果总结

存在hIgG的NGL-Impact® A

研究评估了Repligen NGL-Impact® A ELISA试剂盒的性能,即相比不含hIgG的标准品,对含有hIgG的样品中的NGL-Impact® A的检测。 NGL-Impact® A 加标样品稀释至分析板时的起始hIgG浓度为0.5 mg/ml,或使用煮沸方法时的起始hIgG浓度为10 mg/ml。 每个加标样品均制备3个重复,按照试剂盒的标准方案进行ELISA实验。 

数据处理

标准曲线数据点拟合至线性回归曲线。该方程式允许对样品NGL-Impact® A 浓度进行反算并计算LoQ值。回收率计算如下:

% 回收率 =         计算的浓度  X100
                      理论浓度


分析内精确性

表1.标准曲线样品的分析内精确性(无hlgG)

浓度 (ng/ml) 平均 % CV
1.6 0.8
0.8 5.3
0.4 2.0
0.2 1.3
0.1 5.7
0.05 7.1

 

表2. 使用Dilute & Go时,含hlgG样品的分析内精确性

浓度 (ng/ml) 计算的
浓度
平均 % CV
1.0 1.09 1.0
0.5 0.58 2.6
0.25 0.26 2.4

 

表3.使用Boil & Boost时,含hlgG样品的分析内精确性

浓度 (ng/ml) 计算的
浓度
平均 % CV
1.0 1.10 3.4
0.5 0.50 3.5
0.25 0.24 1.6

 

分析间精确性

表4.标准曲线样品的分析间精确性(无hlgG)

浓度 (ng/ml) 平均 % CV
1.6 1.0
0.8 3.1
0.4 3.2
0.2 2.6
0.1 7.2
0.05 21.1*

*浓度低于LLOQ

表5. 使用Dilute & Go时,含hlgG样品的分析间精确性

浓度 (ng/ml) 计算的
浓度
平均 % CV
1.0 1.09 6.2
0.5 0.58 2.4
0.25 0.26 5.5

 

表6. 使用Boil & Boost时,含hlgG样品的分析间精确性

浓度 (ng/ml) 计算的
浓度
平均 % CV
1.0 1.10 3.7
0.5 0.50 7.5
0.25 0.24 4.7

 

准确性

表7.标准曲线样本的准确性

浓度 (ng/ml) 平均 % 误差 平均%回收率
1.6 -2.5 97.5
0.8 6.3 106.3
0.4 14.2 114.2
0.2 8.6 108.6
0.1 -10.6 89.4
0.05 -51.6* 48.4*

*浓度低于LLOQ

表8. Dilute & Go对于含hlgG样品的准确度

浓度 (ng/ml) 平均 % 误差 平均%回收率
1.0 8.6 108.6
0.5 15.1 115.1
0.25 3.7 103.7

 

表9. Boil & Boost对于含hlgG样品的准确度

浓度 (ng/ml) 平均 % 误差 平均%回收率
1.0 9.8 109.8
0.5 0.1 100.1
0.25 -5.6 94.4

 

定量限(LoQ)

无IgG存在时,由标准曲线确定的LoQ经计算为0.07 ng/ml。有hIgG存在时,NGL-Impact® A 加标样品的LoQ使用Dilute & Go方法时为0.87 ppm,使用Boil & Boost 方法时为0.048 ppm。 

检测限 (LoD)

由标准曲线确定的LoD经计算为0.06 ng/ml。有hIgG存在时,NGL-Impact® A加标样品的LoQ使用Dilute & Go方法时为0.64 ppm,使用Boil & Boost 方法时为 0.04 ppm。 

稀释线性

图1. 在含有IgG的整个检测浓度范围内,使用Dilute & Go和Boil & Boost方法,稀释线性均显示出准确性的高相关性。

linearity-of-dilution-by-boil-and-boost.png

linearity-of-dilution-by-dilute-and-go.png

结论

分析内数据显示,标准曲线样品的精确性在可接受参数范围内,%CV值范围为0.8-7.1%。分析内数据显示,样品分析相对准确且精确。  

分析间数据显示数据具有可重复性。浓度等于或高于LoQ时,分析间变异系数低于或等于7.2%。样品分析间精确性范围为2.4-7.5%。

高于LoQ的浓度的准确性,以%相对误差计量,标准品为-10.6 - 14.2 ,使用Dilute & Go方法和Boil & Boost方法分析的样品为-5.6 - 15.1。 

无IgG存在时,由标准曲线确定的LoQ经计算为0.07 ng/ml。有hIgG存在时,NGL-Impact® A 加标样品的LoQ使用Dilute & Go方法时为0.87 ppm,使用Boil & Boost 方法时为0.048 ppm。 

由标准曲线确定的LoD经计算为0.06 ng/ml。有hIgG存在时,NGL-Impact® A加标样品的LoQ使用Dilute & Go方法时为0.64 ppm,使用Boil & Boost 方法时为 0.04 ppm。 

所有等于或高于LoQ的样品浓度的%CV值为1.0-3.5%,低于15%的限值。  
 

计算说明

精确性 (%CV)

精确性的计算方法是确定NGL-Impact® A加标样品数据点之间的标准偏差,并除以平均值。根据“行业指南:生物分析方法验证”内容,精确性应在15 %以内。

分析内精确性

通过对所有分析的%CV值进行平均,计算每个NGL-Impact® A加标样品浓度的分析内精确性。

分析间精确性

通过确定三次分析中每次计算结果之间的标准偏差,然后除以平均值,可以计算出每个浓度点的分析间精确性。

定量限(LoQ)

定量限值(LoQ)定义为0 ng/ml 样品的标准偏差的10倍。0 ng/ml OD值的标准偏差乘以10,然后与基数0 ng/ml OD值相加。再将求和值输入线性方程生成LoQ。对于每个试剂盒,LoQ以ng NGL-Impact® A 每 ml(ng/ml)缓冲液为单位报告,在含有hIgG条件下,运行NGL-Impact® A加标样品时,以ng NGL-Impact® A 每mg hIgG(ppm)为单位报告。 

检测限 (LoD)

检测限(LoD)定义为3乘以0 ng/ml Protein A样品的标准偏差。将0 ng/ml OD值的标准偏差乘以3然后加到基本0 ng/ml OD值。然后通过将总和值输入标准曲线方程来生成 LoD。对于每个试剂盒,LoD 报告为 ng NGL-Impact ® A/ml (ng/ml) 缓冲液,以百万分之一 (ppm) 为单位对 IgG 浓度进行报告。

准确性

准确性描述为与理论加标浓度相比,分析确定的回收率%
 

标准曲线示例

NGL-impact-A-Standard-Curve.png