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常见问题

常见问题 | 实验室透析

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A)生物技术级 RC、CE和PVDF膜应在去离子水中漂洗15至30分钟,以去除叠氮化钠防腐剂。

B)Spectra/Por® 7 标准级RC膜已经过预处理,去除了痕量水平的重金属和硫化物,仅需在去离子水中漂洗15到30分钟,以去除叠氮化钠防腐剂。

C)Spectra/Por®1 - 6 标准级RC膜可能需要一些额外的准备步骤。在水中漂洗Spectra/Por® 1 - 6 通常足以去除甘油或防腐剂,此外,Repligen提供两个透析膜预处理溶液套装,以去除在生产过程中引入的痕量水平重金属和硫化物。对于超敏感的应用,如结合研究或极低水平的污染物存在即可干扰透析样品的下游分析时,建议使用重金属漂洗液和硫化物去除液套装进行透析膜管处理。更多产品信息,请参考膜透析配件页面。

透析是溶解的溶质在浓度梯度的驱动下,穿过选择性半透膜,以达到平衡的过程。小于膜孔的溶质穿过膜,而较大的溶质被截留在另一侧。

通过更换膜外侧的透析缓冲液,您可以连续去除较小的溶质,从而纯化被截留的大分子。通常,一天内多次更换缓冲液,并在室温条件下,置于搅拌器上过夜,透析的效率最高。透析的标准方案是16至24小时。影响透析速率的因素很多,包括:扩散系数、pH、温度、时间、物质浓度、样品量、透析液(缓冲液)体积、透析液更换次数、膜表面积、膜厚度、分子电荷和透析液搅拌。

透析液体积越大,小分子扩散的驱动力越大。我们通常建议缓冲液和样品体积之比为 100:1 。通过在扩散速度减慢且溶液接近平衡时更换缓冲液,可以保持驱动力和透析速度。我们一般建议在12 - 24小时内更换两或三次缓冲液,如下所示:

  • 第一次缓冲液更换: 2-3 小时之后
  • 第二次缓冲液置换: 4-5 小时之后
  • 最后一次缓冲液更换:放置过夜之前。

MWCO应选择尽可能高,以使透析速率最大化。但是,为了获得更高的样品回收率,您可以选择约为需要截留的大分子分子量一半的MWCO规格。对于需要分离分子的应用,两种物质的分子量之间必须至少有一个5 倍的差异才能使膜透析有效。否则,您可能需要其它的分离技术,比如层析或TFF过滤。

每种类型的膜对不同的分子表现出不同的亲和性。对于球蛋白,相对结合亲和性为CE <RC <PVDF。

标准级RC膜 (Spectra/Por® 1-7) 和生物技术级RC采用柔软的再生纤维素聚合物制造,可以使用任何类型的透析膜夹密封。生物技术级CE和PVDF采用更为刚性的聚合物制造,需要使用更为温和的通用膜夹,因其适用于所有类型的透析膜管,当对膜夹选择有疑问时,可选择使用通用膜夹。标准膜夹仅可用于标准级RC透析膜管。 

建议膜夹密封宽度比透析膜管扁平宽度长4-10 mm。最小的通用膜夹的密封宽度为50 mm。这可密封我们所有扁平宽度规格的生物技术级膜管。 

干型包装透析膜的保质期为 5 年。湿型包装 (0.05% 叠氮化钠溶液) 膜的保质期为 3 年。辐照膜的保质期为 1.5 年。 

如果润湿后的膜变干,会对孔径造成不利影响,膜会变脆,且可能泄漏。此时膜应丢弃。 

如果膜冻结,冰晶可能会使膜破裂并导致泄漏。建议不要使用该膜。但是,您可以尝试缓慢升高温度,直到存储溶液完全融化。但膜不再完整的可能性仍然存在。 

不。Repligen生产供实验室使用的透析膜。 

只要膜是完整的,膜上的卷痕或折线就不会影响扩散性能。 
 

纤维素酯(CE)膜中的聚合物交联形成更为刚性的分子晶格,而再生纤维素(RC)聚合物则形成更柔韧的晶格结构。不透明是由于更为刚性的框架中的膜孔所导致的。孔径越大,膜越不透明。 

CE和RC透析膜只可以机械密封。但是,PVDF透析膜可机械密封或热密封,且出于样品“包封”目的时,通常使用热密封方式。 

我们不建议重复使用透析膜,因其可能会因操作而被污染,且透析条件(pH、温度、化学暴露等)可能会改变膜的完整性和/或引起泄漏,特别是在取下和重新夹上膜夹时。透析膜设计为一次性使用。 

由于透析膜由海绵状基质组成,因此通过评估其截留分子量(MWCO)为特征的截留性能,而间接测量其“孔径”更为合适和实用。 MWCO定义为17小时内被膜截留90%的溶质的分子量。因此,您应该选择MWCO刚好小于您要截留的溶质的大小的膜。 

Spectra/Por® 2 和 4 均提供MWCO 12-14 kD规格。 Spectra/Por® 4 更适合常规透析应用,而Spectra/Por® 2 可提供更高或更低的扁平宽度和/或更高的渗透性;亦即,Spectra/Por® 2 的水渗透性较Spectra/Por® 4更为出色。 

表面积与体积之比与膜管扁平宽度有关。如果您有两段长度相等的膜管,而其扁平宽度不同,扁平宽度较小的膜管具有较高的表面积与体积之比,透析速度更快,而扁平宽度较大的膜管具有较低的表面积与体积之比,透析速度较慢。较小的扁平宽度具有较短的扩散距离,且溶质通过膜孔的竞争更低。扁平宽度较大时,分子与膜壁的距离更长,溶质通过膜孔的竞争也更高。通常,表面积与体积之比越大,透析越快。 

大多数透析是在没有跨膜渗透压的情况下进行的。透析过程由透析膜管内部和外部的浓度梯度所驱动。如果渗透压差异很大,水将流过膜。如果过多的水透过膜迁移,则透析膜管可能会破裂或塌陷,具体取决于水迁移的方向。 

透析膜不是针对压力过滤而设计的。在不影响MWCO的前提下,建议的最大压力为1.5 psi。 

生物分子必须保持在严格的pH值控制条件下才能稳定其分子特性。透析缓冲液的典型pH范围是6至8 。以下是生物分子溶液常见的一些溶液/缓冲液: 

  • Water
  • PBS:磷酸盐缓冲液
  • TBS:Tris 缓冲盐溶液
  • HEPES
  • 氨基酸缓冲液

尽管溶解的分子的大小由以道尔顿为单位的分子量(MW)单位定义,但颗粒和细胞的大小由公制直径定义,因为MW单位不太实用,且没有考虑微观范围内的形状。由于微米是2维距离的量度,而道尔顿是3维尺寸的量度(基于原子量单位),因此两者之间没有从一个到另一个的直接转换方式。由于这个原因,对许多常见的生物材料都针对透析、超滤和微滤目的进行了表征,并绘制在转换图上,以关联近似比例,作为估算转换的参考。有关道尔顿和公制单位之间进行转换的信息,请参阅我们网站上的孔径对照表。 

如果可能,我们建议在低盐浓度的缓冲液中进行透析。不建议在纯去离子水中进行透析,因为这会导致渗透压将水吸入膜管,使膜管膨胀,并可能使膜破裂。使用溶质(盐)浓度逐步降低的一系列缓冲液,进行连续透析,可防止渗透压导致膜溶胀。尝试在每次更换缓冲液时,使溶质浓度的数量级之比为10:1 。例如,含有5 M NaCl的样品使用500 mM NaCl缓冲液进行透析。 

我们强烈建议不要在膜管上打绳结。绳结不能有效地防止泄漏。只有透析膜夹才能为样品的安全透析提供足够的密封。 

除了每种膜管的扁平宽度外,Repligen还列出了相关的体积/长度比,可用于计算容纳样品量所需的膜管长度。例如,如果扁平宽度为16 mm,则体积/长度比为 0.79 ml/cm。要容纳5 ml的样品,您需要大约 6.5 cm的长度。但是,您还需要增加大约10至20 %(至少为1 cm)的长度,以留出顶部空间(空气),以使样品保持漂浮状态。最后,您还需要在两端留出足够的长度,大约2 cm,以允许使用膜夹密封。膜管总长度将至少为11.5 cm。计算所需膜管长度的简单公式如下: 

总长度=(样品体积)/(体积/长度)+(额外的10 - 20 %)+ 4 cm